Nature重磅：275000个单细胞的转录组，几乎完全阐明果蝇视神经叶的神经元多样性

撰文 | Qi

来源 | BioArt

解密神经元多样性的建立和维持需要在整个发育过程中对神经元基因表达具备详细了解。与哺乳动物的大脑相反，果蝇视神经叶（optic lobe）及其连接体的神经元多样性几乎完全被表征。视神经叶占果蝇脑的三分之二，每个神经叶包含约60000个神经元，以及约200种形态独特的神经元类型【1-3】。感光器检测到的视觉信息被整合到视神经的四个神经纤维网中，包括视神经节层（lamina），髓层（medulla），视小叶（lobula）和视小叶板（lobula plate）。大多数视神经元是在幼虫晚期和蛹早期发育连续不断地产生的，在出生后神经元会立即发生投射以构建所有神经柱和原生层，并于蛹期30%（pupal, P30）完成，在P45左右开始形成突触，持续至羽化完成【4-6】。

这些过程是遗传上固定的且似乎是由神经元身份的初始规范严格确定的，因为特定细胞类型的形态及其突触伴侣的身份在很大程度上都是不变的，但是截至目前，仍不清楚神经元如何在整个发育过程中建立并保持形态和功能多样性，以及如何实现大脑连接。因此，表征由神经元在其发育的不同阶段实施的共享的和特定于细胞类型的遗传程序至关重要。

2020年11月4日，来自美国纽约大学的Nikolaos Konstantinides团队和Claude Desplan团队在Nature 杂志上合作发表了一篇题为“Neuronal diversity and convergence in a visual system developmental atlas” 的文章，在这项研究中，作者通过获取果蝇成年期和五个蛹期的共275000个单细胞的转录组，并建立了机器学习框架，几乎完全阐明果蝇视神经叶的神经元多样性，这一研究成果可以成为理解物种间大脑发育的范例。

先前的研究通过对分离的细胞类型生成的果蝇成年视神经叶单细胞转录组图谱未能完全说明其细胞多样性。为此，作者首先获取了成年果蝇109743个单细胞转录组并进行聚类分析，并由此扩展到发育中的神经元，对涵盖神经元分化所有阶段的五个蛹期共150000个单细胞进行测序。由于发育中的神经元通常缺乏标记基因或可用的大量转录组，因此作者采用一种有监督的方法来注释这些数据集，在每个阶段使用多任务神经网络分类器将发育中的细胞与成年簇顺序匹配。通过这种迭代的“分类-调整-重新训练”的方法，成功完成蛹期和成年细胞间的对应关系（具体分析流程见下图1）。截至目前，以上数据集可能共同代表了复杂的中枢神经结构在整个发育过程中的第一个单细胞图谱。

图1，整个发育过程中视神经叶的高分辨率转录组图谱

在这期间，作者在蛹期数据集中发现两个大型神经元簇，在P70阶段强表达促凋亡基因sickle，提示这些细胞在蛹后期阶段死亡，也刚好印证了其不存在于成年数据集中。相反，如果表达抗凋亡蛋白p35则会使这类神经元持续存在于成年大脑中，因此，作者将这些细胞命名为瞬态外在神经元（transient extrinsic, TE）。

对两个TE簇之间差异表达基因的分析显示，其中一个簇表达Wnt4，且仅在TE神经元的腹侧簇中表达因而命名为TEv；而另一个表达Wnt10的簇命名为TEd。此外，作者在P15和P30阶段发现第三个TE簇，将其命名为TEe（e代表early，即早期）。TE神经元的瞬时性质，其表面神经支配及其在分泌标记物中的富集可以联系哺乳动物Cajal–Retzius细胞，这对于神经元迁移和其他发育过程至关重要，未来需要进一步的研究以确认TE细胞在果蝇脑发育中是否具有类似功能。

为了解释为什么在发育过程中更容易区分神经元类型，接下来，作者在每个阶段对神经元簇标记物进行了GO分析。作者发现在所有阶段，与轴突和树突发育及突触形成相关的受体结合和活性呈压倒性的富集趋势，其次是转录因子和离子通道相关。涉及突触发生和膜电位的细胞表面分子在P50-P70附近位置显著上调，这也解释了这些阶段神经元多样性的增加。相比之下，较早蛹期的标志物以蛋白质合成为主，而成年标志物则以能量代谢为主。这些数据提示，P50附近具有突触特异性相关细胞表明分子的上调会引起转录多样性达到峰值。然而，这种多样性不会继续维持，尤其是在执行高度相关功能的亚型之间。

果蝇的背侧（朝向天空）及腹侧（朝向地面）会受到不同的刺激，因此可能需要以不同的方式进行处理。先前已有研究表明蝴蝶，蜻蜓等的视网膜中存在背腹侧的不对称性，这可能是对飞行的基本适应。作者对两个Tm9亚组在P50差异基因表达的分析表明，类似于在上述TEv和TEd神经元中观察到的，两个分别表达Wnt4和Wnt10，且Wnt4-Gal4表达仅与腹侧Tm9s重叠。

此外，Wnt4-Gal4表达仅限于蛹阶段的腹侧光感受器R7和R8，因此在发育过程中，感受视野及其下游环路由差异Wnt信号划分。此外，作者还发现了另外两个具有背腹不对称性的神经元：Tm4和未知簇62，也可以划分为Wnt4+和Wnt10+群，且只有腹侧Tm4神经元与Wnt4-Gal4表达重叠。值得注意的是，Tm4d和Tm9d在成年果蝇中都特异表达了编码5-羟色胺受体的5-HT1A，同样增加了果蝇腹侧和背侧视觉环路中神经调节信号处理方式不同的可能性。

图2，背侧和腹侧视觉环路通过差异的Wnt信号进行分隔

总的来说，这项分析揭示了两个蛹期特异性神经元簇，与哺乳动物的Cajal-Retzius细胞具有许多相似特征，可能参与了神经纤维网的发育进程。值得注意的是，作者提出发育阶段神经元多样性的增加是由于突触形成中涉及的细胞类型特定细胞表面分子的瞬时上调所致，这也解释了成年大脑中转录组看似无差别的神经元如何由于其发育历史的不同而发挥不同的功能。最后，作者将此研究与先前飞行无脊椎动物视网膜中不对称性的研究相联系，证明腹侧和背侧视觉环路受到差异Wnt信号调控，为来自“地面”和“天空”信息输入的差分处理提供了潜在的机制。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2879-3

制版人：schweine

参考文献

1, Fischbach, K. F. & Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Res. 258, 441–475 (1989).

2, Nern, A., Pfeiffer, B. D. & Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, E2967–E2976 (2015).

3, Wu, M. et al. Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs. eLife 5, e21022 (2016).

4, Ngo, K. T., Andrade, I. & Hartenstein, V. Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user’s guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe. Dev. Biol. 428, 1–24 (2017).

5, Özel, M. N. et al. Serial synapse formation through filopodial competition for synaptic seeding factors. Dev. Cell 50, 447–461.e8 (2019).

6, Hiesinger, P. R. et al. Activity-independent prespecification of synaptic partners in the visual map of Drosophila. Curr. Biol. 16, 1835–1843 (2006).

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